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Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires. Contacto:

587/06 - Coneau

Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires. Contacto: una guía en la elaboración de sus tesis doctorales, con los siguientes objetivos 1 Logo de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, nombre de la originalidad, la rigurosidad metodológica en la elaboración de la Tesis y La Carrera del Doctorado de la

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una nueva clase de complejo transcripcional: ErbB2 actúa de coactivador de Stat3 promovien...

Description

Definición de una nueva clase de complejo transcripcional: ErbB2 actúa de coactivador de Stat3 promoviendo la proliferación en tumores mamarios Béguelin,

Wendy 2010

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires www.digital.bl.fcen.uba.ar Contacto: [email protected] Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr.

Luis Federico Leloir.

Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr.

Luis Federico Leloir.

It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.

Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

DEFINICIÓN DE UNA NUEVA CLASE DE COMPLEJO TRANSCRIPCIONAL: ErbB2 ACTÚA DE COACTIVADOR DE STAT3 PROMOVIENDO LA PROLIFERACIÓN EN TUMORES MAMARIOS TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TÍTULO DE DOCTOR DE LA UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES EN EL ÁREA CIENCIAS BIOLÓGICAS

WENDY BÉGUELIN DIRECTORA DE TESIS: DRA.

PATRICIA V.

ELIZALDE CONSEJERO DE ESTUDIOS: DR.

OMAR COSO

INSTITUTO DE BIOLOGÍA Y MEDICINA EXPERIMENTAL

BUENOS AIRES,

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral dieron origen a la siguiente publicación:

Progesterone receptor induces ErbB-2 nuclear translocation to promote breast cancer growth via a novel transcriptional effect: ErbB-2 function as coactivator of Stat3.

Béguelin W,

Díaz Flaqué MC,

Proietti CJ,

Cayrol F,

Rivas MA,

Tkach M,

Rosemblit C,

Tocci JM,

Charreau EH,

Schillaci R,

Elizalde PV

Molecular and Cellular Biology,

2010.

En prensa.

INDICE

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

ABREVIATURAS

Indice

RESUMEN Español

Inglés

INTRODUCCION Cáncer de mama y progesterona

Factores de crecimiento y sus receptores

Familia de receptores con actividad de tirosina quinasa

Familia de receptores ErbBs y sus ligandos

Receptores ErbBs en el núcleo celular

Respuestas biológicas a heregulina (HRG)

ErbBs,

HRG y cáncer de mama

El receptor de progesterona

Mecanismos de acción del receptor de progesterona Efectos genómicos

Efectos no genómicos

Receptor de progesterona y cáncer de mama Proteínas transductoras de señales y activadoras de la transcripción

32 33

Mecanismos de acción de las Stats

Stat3 como reguladora de la transformación celular

Ciclina D1 y cáncer de mama

OBJETIVOS

MATERIALES Y METODOS Animales

Tumores C4HD

Reactivos

Soluciones utilizadas para los cultivos

Cultivos primarios de tumores C4HD

Líneas celulares y tratamientos

Medios de cultivo y suero fetal bovino

Preparación de extractos proteicos totales

Preparación de extractos citosólicos y nucleares

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Indice

Ensayos de Western Blot

Inmunoprecipitaciones

Plásmidos

Transfecciones transientes

Transfecciones con ARN de interferencia (siRNA)

Ensayos de inmunofluorescencia y microscopía confocal

Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) y re-ChIP

PCR cuantitativa en tiempo real

Extracción de ARN,

transcripción reversa y PCR en tiempo real

Ensayos de proliferación

Análisis del ciclo celular por citometría de flujo

Experimentos in vivo

Preparación del pellet de HRG

RESULTADOS PRIMERA PARTE HRG induce la translocación de ErbB2 al núcleo y su colocalización con Stat3

La translocación de ErbB2 y Stat3 al núcleo inducida por HRG ocurre de manera independiente una de la otra

HRG migra al núcleo e induce la translocación de ErbB3 y la asociación con ErbB2 en el núcleo

ErbB2 y Stat3 participan en el mecanismo de la expresión de ciclina D1 inducida por HRG HRG induce la acción de ErbB2 como coactivador de Stat3

77 82

Unión del complejo transcripcional Stat3/ErbB2 en el promotor de ciclina D1

La localización nuclear de ErbB2 es fundamental para la proliferación de células de cáncer de mama

El bloqueo de la localización nuclear de ErbB2 inhibe el crecimiento in vivo de tumores mamarios

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Indice

SEGUNDA PARTE El acetato de medroxiprogesterona (MPA) induce la activación de ErbB2 y su migración hacia el núcleo MPA induce la colocalización nuclear de ErbB2 y Stat3

105 111

La translocación de ErbB2 y Stat3 al núcleo inducida por MPA ocurre de manera independiente una de la otra

ErbB2 actúa como coactivador de Stat3 en un mecanismo transcripcional inducido por MPA

ErbB2 actúa como coactivador de Stat3 co-reclutando a PR y las histonas acetiltransferasas CBP y p300 en el promotor de ciclina D1

La localización nuclear de ErbB2 es fundamental para la proliferación progestágeno-dependiente de células de cáncer de mama

El bloqueo de la localización nuclear de ErbB2 inhibe el crecimiento in vivo de tumores mamarios que expresan receptores de hormonas esteroideas y ErbB2

DISCUSION Formación del complejo nuclear Stat3/ErbB2 inducida por HRG y MPA

Interacción nuclear entre Stat3,

ErbB2,

ErbB3 y HRG

ErbB2 transloca entero al núcleo,

donde se encuentra fosforilado en los residuos tirosina 1222 y 877 La proteína quinasa Src funciona de intermediario entre PR y ErbB2

148 149

Importación nuclear de Stat3 y ErbB2: ambas deben estar fosforiladas para translocar al núcleo y para interactuar Complejo transcripcional nuclear Stat3/ErbB2

149 151

Unión de PR al complejo transcripcional Stat3/ErbB2 en el promotor de ciclina D1

Formación del complejo nuclear Stat3/ErbB2 inducida por HRG

Acción de ErbB2 como coactivador

Relación de Stat3 y ErbB2 con la tumorigénesis mamaria

Acción de la mutante hErbB2∆NLS versus trastuzumab

Implicancias terapéuticas del uso de hErbB2∆NLS

REFERENCIAS

ABREVIATURAS

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Abreviaturas

AFs: dominios de activación de la transcripción ChIP: inmunoprecipitación de la cromatina COX-2: ciclooxigenasa tipo II DBD: dominio de unión al DNA DMEM-F12: medio de Eagle modificado por Dulbecco EGF: factor de crecimiento epidérmico EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico ER: retículo endoplasmático FGF: factor de crecimiento de fibroblastos FGFR: receptor del factor de crecimiento de fibroblastos HAS: HER2 associated sequence HRG: heregulina HRT: terapia de reemplazo hormonal Ig: inmunoglobulina IGF-I: factor de crecimiento semejante a insulina de tipo I IGF-IR: receptor del factor de crecimiento semejante a insulina de tipo I IP: inmunoprecipitación IR: receptor de insulina Jaks: Janus activated kinases LBD: dominio de unión al ligando MAPKs: proteínas quinasas activadas por mitógenos MPA: acetato de medroxiprogesterona NLS: señal de localización nuclear O.N.: toda la noche pb: pares de bases PBS: buffer fosfato salino PDGF: factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGFR: receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas PI3K: fosfatidil inositol 3 quinasa PR: receptor de progesterona PR-A: isoforma A del receptor de progesterona PR-B: isoforma B del receptor de progesterona PRE: elemento respondedor a progesterona PTEN: homólogo de fosfatasa y tensina 7

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Abreviaturas

pY: residuo tirosina fosforilado RTK: receptor con actividad intrínseca de tirosina quinasa RTK-I: receptor con actividad intrínseca de tirosina quinasa tipo I SD: desviación estándar SDS-PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio SEM: media del error estándar SFB: suero fetal bovino SFBch: Suero fetal bovino libre de esteroides por adsorción con carbón activado o “charcolizado” SH2: dominio SRC homology 2 SH3: dominio SRC homology3 siRNA: RNA corto de interferencia Stat: proteína transductora de señales y activadora de la transcripción TGF: factor de crecimiento transformante VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular WB: Western Blot

RESUMEN ABSTRACT

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Resumen

Definición de una nueva clase de complejo transcripcional: ErbB2 actúa de coactivador de Stat3 promoviendo la proliferación en tumores mamarios

El receptor con actividad de tirosina quinasa ErbB2 y la proteína transductora de señales y activadora de la transcripción 3 (Stat3) juegan un rol importante en el desarrollo del cáncer de mama.

Distintas evidencias sugieren la existencia de interacciones cruzadas entre ErbB2 y Stat3.

Sin embargo,

los mecanismos moleculares que subyacen a esta interacción en tumores mamarios permanecen poco estudiados.

En este trabajo identificamos un nuevo mecanismo de interacción entre ErbB2 y Stat3 que involucra la translocación nuclear de ErbB2 y la formación de un complejo en el que ErbB2 actúa como coactivador transcripcional de Stat3.

Mostramos que la formación de este complejo es inducida tanto por el ligando de los receptores ErbBs,

como por los progestágenos a través del receptor de progesterona (PR).

Demostramos también que la función de ErbB2 como coactivador de Stat3 promueve la activación del promotor de ciclina D1.

Cuando la formación del complejo Stat3/ErbB2 es inducida por progestágenos,

encontramos al PR co-reclutado en el promotor de ciclina D1,

revelando un nuevo mecanismo de acción genómico no clásico del PR.

Demostramos que la presencia de ErbB2 en el núcleo celular ejerce un rol fundamental en la proliferación in vitro e in vivo en tumores mamarios.

Estos hallazgos revelan una posible intervención terapéutica nueva en tumores de mama que sobreexpresan ErbB2,

mediante la inhibición de la translocación nuclear de ErbB2,

dado que esta estrategia es efectiva en células tumorales resistentes a las terapias anti ErbB2 convencionales.

Palabras clave: Stat3,

ErbB2,

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Abstract

Defining a new class of transcriptional complex: ErbB2 acts as coactivator of Stat3 inducing proliferation in breast tumors

ErbB2 tyrosine kinase receptor and Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (Stat3) have been unraveled as two major players in breast cancer growth.

In spite of all the accumulating evidence suggesting a crosstalk between ErbB2 and Stat3,

the molecular mechanisms underlying ErbB2 and Stat3 interaction in breast tumor remain poorly explored.

In this work,

we identified a new mechanism of ErbB2 and Stat3 interaction,

which involves ErbB2 nuclear translocation and the assembly of a complex in which ErbB2 acts as a transcriptional coactivator of Stat3.

We showed that the assembly of this complex is induced by heregulin,

a ligand of the ErbBs receptors,

as well as by ligand bound progesterone receptor (PR).

We also highlighted that ErbB2 function as Stat3 coactivator drives cyclin D1 promoter activation.

When the assembly of Stat3/ErbB2 complex is induced by progestins,

we found PR recruitment together with Stat3 and ErbB2 to the cyclin D1 promoter,

unraveling a new nonclassical PR genomic mechanism.

We found that the nuclear Stat3/ErbB-2 transcriptional complex plays a key role in in vitro and in vivo proliferation of breast tumors.

Our findings reveal a novel therapeutic intervention in ErbB2-overexpressing breast tumors,

by inhibition of ErbB2 nuclear translocation,

since this strategy has proven effective in tumor cells which are resistant to conventional anti ErbB2 therapies.

Key words: Stat3,

ErbB2,

Tesis Doctoral Lic.Wendy Béguelin

Agradecimientos

A mi directora,

Patricia Elizalde,

por la formación científica que me brindó y por darme la oportunidad de formarme en su equipo,

por su compromiso y dedicación para llevar adelante nuestro grupo de trabajo.

Al Dr.

Charreau por habernos brindado todo su apoyo desde la dirección del instituto.

Al Dr.

Alfredo Molinolo,

por sus consejos y aportes al trabajo del laboratorio.

A la Dra.

Claudia Lanari,

por su modelo experimental utilizado en esta Tesis.

A la Agencia y al CONICET,

por el sustento económico para el desarrollo de mi Tesis.

A la UBA,

por haberme brindado una excelente educación desde la facultad.

A la patóloga Isabel Frahm por los análisis histopatológicos de los tumores y órganos de los ratones.

A los patólogos Pablo Guzmán y Esteban Maronna por las fotos tomadas de las secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina.

A Cele,

mi “laotong” del laboratorio,

por su excelente disposición permanente para ayudarme en todo,

pero fundamentalmente por su compañerismo,

su amistad y las innumerables conversaciones y salidas extra-labo.

A Roxana,

Cecilia,

Franco,

Rocío,

Martín y Mer,

por estar siempre bien dispuestos,

por su amistad y constante apoyo,

y porque hacen posible que el laboratorio sea un lindo lugar de trabajo.

A Vicky,

Roxana,

Martín y Cele por sus correcciones y críticas a esta Tesis.

A Marian,

mi primera mentora que me enseñó a trabajar en un laboratorio y a dar los pasos iniciales en el mundo de la investigación.

A mis recientes ex-compañeros de laboratorio Cin,

Romi,

Flor y Nazareno por haber sido excelentes compañeros,

A Cin por su constante ayuda a distancia.

A mis “vecinas” Lili,

Violeta,

Ana Rosa,

Betina,

Caro,

Marianita,

Agus,

a los chicos de los laboratorios de Gabi Rabinovich y de Claudia Lanari y toda la gente del IBYME,

A mis amigos Juan,

Mari,

Pauni,

Luis,

Romi,

Mili,

Ceci V.,

Javi,

Lucas,

Monse,

Juli,

Petu,

Ceci F.,

Juan (Arjona),

Lara,

Flor,

Chuky,

Martín (Rosario),

Lucho,

Loche,

Viqui por todos los buenos momentos que compartimos y por estar siempre.

A mis amigos Carla,

Jay y Dani,

por enseñarme a “enyoguisarme”,

A mi amiga de la vida Laura,

A mamá y papá,

por darme la oportunidad de crecer libremente,

por confiar en mí y apoyarme permanentemente.

A los demás integrantes de mi familia: mami,

Zenón,

Yuquita,

Marien,

Pedro,

José y Victoria,

Luis (Suegrus),

Silvia,

Fernando,

Matías,

Carla,

Mer y Guido por estar siempre dispuestos a ayudar,

escucharme o aconsejarme si lo necesito y por la alegría que todos tienen.

A Luis,

por alentarme y apoyarme en todo lo que hago,

por su constante asistencia de tipo académica,

INTRODUCCIÓN

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Introducción

CÁNCER DE MAMA Y PROGESTERONA

El cáncer de mama es la primera causa de muerte por cáncer en las mujeres y la segunda a nivel mundial (sólo superada por el cáncer de pulmón).

La incidencia del cáncer de mama ha ido aumentando de 1:20 mujeres en 1960 a 1:7 mujeres hoy.

La National Breast Cancer Foundation estima que cada año,

alrededor de 200.000 mujeres serán diagnosticadas con cáncer de mama y más de 40.000 morirán por esta enfermedad.

Aproximadamente,

Por su parte,

el National Cancer Institute (NCI) estima que a una de cada ocho mujeres que viva hasta los 85 años se le diagnosticará cáncer de mama durante su vida.

En Argentina,

existe un subregistro de mortalidad por cáncer debido a aquellos casos en los cuales la causa que se registra en el informe estadístico de defunción es imprecisa,

como por ejemplo “paro cardiorespiratorio”,

a pesar de que el individuo haya fallecido por cáncer u otro motivo.

Sin embargo,

se calcula entre 15.000 y 18.000 nuevos casos de cáncer de mama por año siendo la primera causa de muerte por cáncer en las mujeres de nuestro país (Matos et al.

2003).

Dada su altísima incidencia,

la investigación en cáncer de mama es considerada prioritaria.

Según datos epidemiológicos la incidencia del cáncer de mama no sólo aumenta con la edad sino que la mayor tasa de incremento ocurre durante los años reproductivos (Pike y Spicer 2000

Bernstein 2002) observándose un marcado pico de incidencia en la etapa de la premenopausia.

Este aumento en la incidencia estaría causado por los efectos acumulativos provocados por la proliferación que inducen los esteroides sexuales ováricos sobre el epitelio mamario (Henderson y Feigelson 2000).

Con cada sucesivo ciclo menstrual,

la proliferación de las células del epitelio mamario,

dirigida por los esteroides sexuales,

puede resultar en la adquisición progresiva de mutaciones somáticas en el linaje celular,

lo cual conduciría a la transformación y progresión neoplásica.

Esta hipótesis está avalada por la observación de que una menarca tardía (Apter y Vihko 1983

Apter et al.

Pike y Ross 2000) se correlacionan con una reducción del riesgo de cáncer de mama.

En ambas situaciones,

se minimiza la exposición del epitelio mamario a los esteroides sexuales a lo largo de la vida.

De los esteroides ováricos,

los estrógenos fueron considerados tradicionalmente los principales esteroides sexuales involucrados en la proliferación del epitelio mamario y por extensión en la progresión de dicho linaje al fenotipo neoplásico (Bernstein y Ross 1993

Key 1999

Henderson y Feigelson 14

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Introducción

2000).

Basándose en el efecto antiproliferativo que la progesterona tiene en el endometrio,

en contraposición a los estrógenos,

se asumió que la progesterona ejercería similares efectos inhibitorios en el epitelio mamario y,

no contribuiría significativamente a la iniciación o progresión tumoral (Lydon et al.

2000).

No obstante,

con estos indicios ha sido difícil explicar por qué el índice proliferativo del epitelio mamario era más alto durante la fase luteal del ciclo menstrual dominada por la progesterona (King 1993),

por qué la inclusión de progestágenos en los protocolos de terapia de reemplazo hormonal (hormone replacement therapy,

HRT) incrementó la densidad de las células epiteliales mamarias con respecto a la administración de estrógenos solos (Hofseth et al.

Haslam et al.

2002),

por qué los progestágenos combinados en anticonceptivos orales podían prevenir el cáncer de ovario y endometrio pero no el de mama (Pike y Spicer 2000),

o por qué un gran número de ensayos clínicos mostraron un leve pero significativo aumento en el riesgo de cáncer de mama cuando el progestágeno sintético acetato de medroxiprogesterona (MPA) fue incluido en los regímenes de HRT (Magnusson et al.

Ross et al.

Chlebowski et al.

2003).

En particular,

el ensayo Women’s Health Initiative Randomized Trial,

cuyo objetivo fue determinar la relación entre el uso de estrógenos y progesterona y el cáncer de mama en más de 16.000 mujeres postmenopáusicas en Estados Unidos,

debió ser detenido antes de la finalización del protocolo previsto.

Esta determinación se tomó debido a que las estadísticas para cáncer de mama invasivo,

excedieron los límites permitidos para este efecto adverso (Chlebowski et al.

2003).

Finalmente,

los resultados del estudio clínico The Million Women Study,

que investigaba la relación entre distintos patrones de uso de HRTs e incidencia de cáncer de mama y mortalidad en más de un millón de mujeres inglesas,

permitió interpretar efectivamente que las HRTs que incluían progestágenos están asociadas a un aumento en el riesgo de cáncer de mama respecto a las que incluyen sólo estrógenos (Beral 2003).

Los efectos de la progesterona en la glándula mamaria son controversiales debido a la complejidad estructural y funcional de este órgano.

Dependiendo del modelo experimental,

del contexto celular y de la duración del tratamiento,

la progesterona puede ejercer efectos proliferativos o antiproliferativos en el crecimiento del epitelio mamario.

Se ha hipotetizado que,

luego de una ronda de proliferación,

el pulso inicial de progesterona actúa como un factor iniciador para las acciones de factores secundarios involucrados en vías proliferativas,

de diferenciación o apoptóticas.

Entonces,

serían los múltiples factores secundarios que regulan el crecimiento y desarrollo de un tumor de 15

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Introducción

en combinación con la progesterona,

los que contribuyen con esta variedad de efectos (Lange et al.

1999).

El concepto primitivo que consideraba a los estrógenos inductores y a la progesterona protectora en el carcinoma mamario se encuentra actualmente y,

a la luz de las explicaciones antes citadas,

Los riesgos y beneficios asociados con la progesterona y los progestágenos sintéticos requieren una mejor comprensión de su función en la biología de células de mama normales y en la desregulación que ocurre en los tumores malignos de mama.

Muchos trabajos,

incluyendo los del laboratorio al cual pertenezco,

demostraron que existe una interacción entre las hormonas esteroideas y las vías de señalización de los factores de crecimiento,

se describían como procesos independientes (Lange et al.

Real et al.

Labriola et al.

2003).

FACTORES DE CRECIMIENTO Y SUS RECEPTORES

Los factores de crecimiento constituyen un grupo de polipéptidos involucrados en la regulación de la proliferación y de la diferenciación celular.

Actúan a través de receptores de membrana con actividad de tirosina o serina-treonina quinasas.

La unión del factor de crecimiento a su receptor inicia una cascada de activación de quinasas intracelulares que conduce a la regulación de la síntesis del ADN por activación de factores de transcripción o bien,

pueden actuar ellos mismos como factores de transcripción.

Los factores de crecimiento pueden actuar como factores autocrinos (o intracrinos),

Entre las neoplasias malignas,

el cáncer de mama constituye un modelo extraordinariamente atractivo para el estudio de la participación de los factores de crecimiento en el proceso de transformación neoplásica.

En efecto,

uno de los pilares centrales de la acción de las hormonas esteroideas es la capacidad de estas hormonas sistémicas de regular la producción local de factores de crecimiento en la glándula mamaria.

La interacción de estos factores con los productos de otros genes inducidos hormonalmente dentro del contexto estructural de la mama,

regula la función glandular y muchas veces participa en el desarrollo del cáncer (Dickson y Lippman 1995).

La mayoría de los factores de crecimiento implicados en el desarrollo del cáncer de mama son polipéptidos mitogénicos como por ejemplo: i) factores de crecimiento 16

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Introducción

que se unen a los receptores con actividad de tirosina quinasa tipo I

ii) factores de crecimiento semejantes a la insulina tipo I y II (IGF-I,

IGF-II)

iii) factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y iv) factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) (Dickson y Lippman 1995).

Muchas de las evidencias más convincentes que relacionan los factores de crecimiento y el cáncer han sido proporcionadas por la gran cantidad de trabajos experimentales en los que se asocian factores de crecimiento y oncogenes.

En efecto,

la clase I de protooncogenes codifica para factores de crecimiento,

mientras que entre los oncogenes de clase II,

se encuentran los que codifican para receptores de factores de crecimiento con actividad de tirosina quinasa,

ampliamente relacionados con la etiología del cáncer de mama (Dickson y Lippman 1995).

Familia de receptores con actividad de tirosina quinasa

Los receptores con actividad de tirosina quinasa (receptor tyrosine kinase,

RTK) forman una familia numerosa de receptores de membrana a los que se une la mayoría de los factores de crecimiento y la insulina.

Estos receptores participan en la regulación normal del crecimiento celular,

la morfogénesis y la diferenciación.

El análisis de la estructura de los RTKs ha revelado que todos poseen un dominio extracelular altamente glicosilado donde está localizado el sitio de unión del ligando (extremo amino terminal),

un dominio hidrofóbico anclado a la membrana plasmática y un dominio citosólico,

en el cual se localiza el sitio catalítico con actividad de tirosina quinasa (extremo carboxi terminal).

En base a la similitud en sus secuencias y diferentes características estructurales,

se clasifican en al menos 19 subclases (Ullrich y Schlessinger 1990).

De todas ellas,

las de mayor interés con relación al cáncer,

son al menos cuatro y se esquematizan en la figura 1: la subclase de tipo I está constituida por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR/ErbB1/HER1),

ErbB2 (HER2/neu),

ErbB3 (HER3) y ErbB4 (HER4)

el receptor de insulina (IR) y el receptor del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-IR)

uno de los miembros más importantes de la subclase III es el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR A y B)

mientras que a la subclase IV pertenecen los receptores de los factores de crecimiento fibroblástico (FGFR).

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Introducción

Figura 1.

Familia de los RTKs.

Se esquematizan los 4 subtipos más importantes.

Los RTK tipo I incluyen a los ErbBs (1-4),

los RTK tipo II incluyen a IR e IGF-IR,

los tipo III a PDGFR (α y β),

mientras que al subtipo IV pertenecen los FG-R (1-4).

En azul,

se esquematizan los dominios de tirosina quinasa

los dominios ricos en cisteína y en gris,

Tomado de (Blume-Jensen y Hunter 2001).

La regulación alostérica de la activación del receptor y las señales de transducción que desencadena,

cobra importancia por el hecho de que se encontró una gran variedad de alteraciones estructurales en oncogenes derivados de estos receptores que lleva a su activación constitutiva y a la consecuente desregulación de los mecanismos de control del crecimiento celular y las señales del receptor favoreciendo el desarrollo del cáncer.

Familia de receptores ErbBs y sus ligandos

Los receptores con actividad de tirosina quinasa tipo I (RTKs-I) o ErbBs se expresan en una gran variedad de tejidos de origen epitelial,

donde ejercen sus efectos sobre la embriogénesis/desarrollo,

proliferación y diferenciación.

La desregulación de la expresión de estos receptores,

en particular de ErbB1 y ErbB2,

ha sido implicada en el desarrollo y la agresividad de numerosos tipos de cánceres humanos (Hynes y Lane 2005).

Los miembros de la familia RTKs-I comparten una estructura molecular común que incluye un dominio extracelular de unión al ligando glicosilado con dos dominios ricos en cisteína,

una extensión simple transmembrana y una larga extensión citoplasmática que contiene los sitios tirosina quinasa y de autofosforilación.

Los miembros de la familia de ligandos del EGF se unen al dominio extracelular de los ErbBs llevando a la formación de homo o heterodímeros.

Consecuentemente,

Tesis Doctoral Lic.

Wendy Béguelin

Introducción

dimerización estimula la actividad tirosina quinasa intrínseca de los receptores disparando la autofosforilación de residuos tirosina específicos en el dominio citoplasmático.

Estos residuos sirven de sitios de anclaje para moléculas que activan cascadas de señalización intracelulares.

Dos de la principales vías activadas por estos receptores son la de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) y la de fosfatidil inositol 3 quinasa (PI3K)/Akt.

Otras proteínas efectoras importantes de la señalización de los ErbBs son: la tirosina quinasa soluble Src

la serina-treonina quinasa mTOR (mammalian target of rapamycin),

que es activada por la vía PI3K/Akt y por otros reguladores del crecimiento

y las proteínas transductoras de señales y activadoras de la transcripción (Stats) que,

han sido frecuentemente asociadas con la activación de EGFR.

Por último,

los efectos río abajo sobre la expresión génica (como las Stats) determinan la respuesta biológica (Olayioye et al.

2000).

De esta manera,

los receptores ErbBs activados regulan múltiples actividades celulares,

y la respuesta biológica específica desencadenada depende de las interacciones cruzadas entre las vías de señalización.

Los ligandos de los RTKs-I se caracterizan por tener en su estructura un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGF-like motif).

Este dominio está definido por seis residuos de cisteína espaciados característicamente dentro de una secuencia de 35-50 aminoácidos formando tres puentes disulfuro.

De acuerdo a su especificidad de unión,

se clasifican en tres familias de ligandos.

El primer grupo se une a EGFR e incluye a EGF,

el factor transformante tipo alfa (TGFα) y anfiregulina.

El segundo está formado por betacelulina,

un EGF capaz de unirse a heparina (HB-EGF),

los tres factores de crecimiento se unen tanto a ErbB1 como a ErbB4 (Riese et al.

1996).

Por último,

la búsqueda de ligandos capaces de activar a ErbB2