PDF -Moleküler Dizileme Teknolojileri - DİZİ ANALİZİ (SEKANS) TEKNİKLERİ
Wait Loading...


PDF :1 PDF :2 PDF :3 PDF :4 PDF :5 PDF :6 PDF :7


Like and share and download

DİZİ ANALİZİ (SEKANS) TEKNİKLERİ

Moleküler Dizileme Teknolojileri

DİZİ ANALİZİ (SEKANS) TEKNİKLERİ PDF MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİdocs neu edu tr 12 20dna 20dizi 20analizi 20yöntemleri 98 pdf PDF Mitokondriyal DNA Sekansı (DNA DİZİ ANALİZ HİZMETİ) TEKNİK ebap pau edu tr SatinalmaUrun TeknikSartname 26304 11a0d480 pdf ; Sekans 20Teknik 20Şartnamesi 20(1) PDF Third

Related PDF

MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

[PDF] MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİdocs neu edu tr 12 20dna 20dizi 20analizi 20yöntemleri 98 pdf
PDF

Mitokondriyal DNA Sekansı (DNA DİZİ ANALİZ HİZMETİ) TEKNİK

[PDF] Mitokondriyal DNA Sekansı (DNA DİZİ ANALİZ HİZMETİ) TEKNİK ebap pau edu tr SatinalmaUrun TeknikSartname 26304 11a0d480 pdf ; Sekans 20Teknik 20Şartnamesi 20(1)
PDF

Third Generation DNA Sequencing - Semantic Scholar

[PDF] Third Generation DNA Sequencing Semantic Scholar pdf s semanticscholar 15f7f7d8b6a006da57c0fdb8e828ef356ed6 pdf
PDF

Untitled - Gazi Üniversitesi İhale Sistemi

[PDF] Untitled Gazi Üniversitesi İhale Sistemiihsis gazi edu tr ihale ihaleftp sartname 9584 3 pdf
PDF

16S rRNA Analizi

[PDF] 16S rRNA Analizi tmc online userfiles 08 Zeynep Ceren Karahan pdf
PDF

ankara üniversitesi tıp fakültesi'ne müracaat eden sağlıklı

[PDF] ankara üniversitesi tıp fakültesi'ne müracaat eden sağlıklı acikarsiv ankara edu tr browse 27275 tez pdf
PDF

Moleküler Dizileme Teknolojileri

31 Eki 2014 Maxim Gilbert dizileme tekniği Dizi başına ~5 USD (baz başına 5 1000USD) Exom ~500 USD ANALİZ TEKNİĞİ ve ALGORİTMA
PDF

duzce bel tr resim upload 4930b pdf 1 DÜZCE BELEDİYESİ (T) PLAKA TİCARİ TAKSİ ÇALIŞMA VE DEVİR YÖNETMELİĞİ BİRİNCİ BÖLÜM Amaç, Kapsam ve Yasal Dayanak Amaç MADDE 1 – (1) Bu yönetmelik, Düzce Belediyesi sınırları içinde vatandaın ulaım ihtiyacını duzce bel tr resim upload 278b pdf

PDF Działając na podstawie art 16 ust 1 ustawy z dnia 15 lipca 1987 r o rpo gov pl Do MPiPS ws oceny funkcjonowania ustawy o praktykach absolwenckich pdf PDF Działając na podstawie ustawy

Działalność przedsiębiorstw leasingowych w 2013 roku

mikro, małych i średnich przedsiębiorstw 2014 FINANSOWANIE

stat gov pl download gfx portalinformacyjny pl defaulta Działalność przedsiębiorstw leasingowych w 2013 roku Badaniem objęte zostały 123 przedsiębiorstwa prowadzące w 2013 r działalność leasingową Z tej zbiorowości 30 przedsiębiorstw było zrzeszonych w Związku Polskiego Leasingu, a 11 w Polskim Związku Wynajmu i Leasingu Pojazdów, w tym cztery

DZIEŃ I czwartek, r.

23 kwietnia - Światowy Dzień Kobiet w ICT

liturgicalcenter media publication Triduum 2 ResP PsAlM R Our blessing cup is a communion with the Blood of Christ How shall I make a return to the Lord for all the good he has done for me? The cup of salvation I will take up,

DZIECKO Z AUTYZMEM I ZESPOŁEM ASPERGERA W SZKOLE I PRZEDSZKOLU

Indywidualne potrzeby dziecka – ucznia z autyzmem Komunikacja

Gabriela Jagielska One są ws,ród nas DziecKO z AUTYzMeM i zespOłeM AspeRGeRA W szKOle i pRzeDszKOlU Informacje dla pedagogów i opiekunów autyzmu, dlatego terapia logopedyczna powinna być jedną z głównych i niezbędnych terapii dzieci z autyzmem i zespołem Aspergera Wydawać by się mogło, 

  1. DziecKO z AUTYzMeM i zespOłeM AspeRGeRA
  2. Dziecko autystyczne i z zespołem Aspergera w przedszkolu i szkole
  3. Dzieci autystyczne iz zespołem Aspergera
  4. Metody i techniki pracy w grupie z dzieckiem z wysoko
  5. Studia Podyplomowe Terapia i edukacja dzieci z autyzmem i
  6. Pielęgniarstwo Problemy rodziców dzieci z autyzmem
  7. Dziecko z Zespołem Aspergera jako
  8. Indywidualne potrzeby dziecka
  9. ucznia z autyzmem
  10. model pracy z uczniem z autyzmem

Dzieje wsi Iwkowa geografia, historia, kultura (zarys) 1 REJESTR ZAPISÓW GRUNTOWYCH WSI IWKOWA

Fotografia na całej stronie - Muzeum Miejskie Suchej Beskidzkiej

PDF Show publication content! RCiNrcin pl Content 63803 WA303 83297 II10371 Wislicz pdf PDF Untitled Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego wuj pl UserFiles File Hajduk Edukacyjne 20fragment1 pdf PDF bibliografia zawartości “rocznika sądeckiego” za lata Nowy

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 170/31

piwlukow weebly uploads 9 3 4 0 93409848 3 2 2018 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 31 93 — gmina Wyszogród w powiecie płockim, — gminy Czer wińsk nad Wisłą i Załuski w powiecie płońskim, bip ms gov pl Data Files public bip prawo

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 343/3

PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 170/31

infor pl download site pl oj 2019 l 124 L L 124 32 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13 5 2019 (1) Dz U L 309 z 24 11 2009, s 1 (2) Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) nr 686 2012 z dnia 26 lipca 2012 r

DZISIAJ TU, JUTRO TAM

APEL – ROZPOCZĘCIE ROKU SZKOLNEGO

korczakowo wp content uploads 2015 06 Dzisiaj tu, jutro tam, każda radość krótko trwa Dobrze z sobą było nam, więc śpiewajmy dzisiaj tu a jutro tam Kiedy Franklin Roosevelt konał, usłyszałem jego głos rzekł z tej wojny zjednoczony wyjdzie świat stary dureń

Home back13401341 1342134313441345 Next

? (SEKAS) TEKİKLERİ DA dizi analizi,

gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bil...

Description

DİZİ ANALİZİ (SEKANS) TEKNİKLERİ DNA dizi analizi,

gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır.

Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA tekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizi analizi yöntemleri de gelişme göstermiştir.

2001).

iki farklı DNA dizi analizi yöntemi bulunmuştur.

Akiyoshi WADA DNA dizi analizinin otomatik olarak yapılmasını önermiştir ve robotlar geliştirilmeye başlanmıştır.

kromozomun DNA Dizi Analizi tamamlanmıştır.

Claire FRASER ve Hamilton SMİTH tarafından Haemophilus influenzea’ ya ait ilk DNA dizisi yayınlanmıştır.

Japonya ve ABD’den bilim adamları tarafından insanın 22.

kromozomunun DNA dizisi tamamlanmıştır.

Arabidopsis thaliana 2000 yılında DNA dizisi açıklanan ilk bitki olmuştur.

DNA Dizi Analizinde günümüzde birbirinden farklı iki yöntem kullanılmaktadır.

Bu iki yöntem

(Sanger et al.,1977).

Bu iki yöntemden,

Sanger – Coulson’un yöntemi günümüzde daha yaygın olarak kullanılmaktadır.

Allan MAXAM ve Walter GİLBERT ‘in geliştirdikleri yöntemin prensibi hidrazin,

dimetil sülfat ya da formik asit ’in,

DNA’ da bulunan bazları özgül olarak değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin değişikliğe uğramış nükleotitlerin bulunduğu noktalardan zinciri kırmasına dayanır (Sambrook,

1989).

Bu yöntemde,

nükleotit dizisi saptanacak olan DNA önce 5’- ucundan 32P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir.

DNA’ nın iki iplikciği birbirinden ayrılarak ya da DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA’ nın yalnızca bir ucundan işaretlenmesi sağlanır.

İkinci adımda ise DNA molekülleri dört tüpe ayrılarak A,

G ya da T nükleotitlerini değiştirmek ve kırmak için gerekli tepkimeler gerçekleştirilir.

Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpde farklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilir.

Sonuçta kırılmanın olduğu pozisyona göre hepsi 5’- pozisyonlarından işaretli ancak boyları birbirinden farklı bir dizi DNA fragmenti elde edilmiş olur.

Elde edilen boyları gittikçe kısalan DNA dizileri,

jel elektroforezi ile birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır ve otoradyografi uygulanarak bantlar görüntülenir (Klug et al.,

2000).

Maxam ve Gilbert Yönteminde Kullanılan Kimyasallar Maxam ve Gilbert

yönteminde özgül bazlar ile zincirlerin kırılmasında kullanılan

kimyasallar aşağıda verilmiştir (Sambrook et al.,

1989).

Kimyasal kırılma yönteminde kullanılan kimyasallar.

Özgül Baz

Baza özgül kimyasal

Baz ayırmada kullanılan Zincir

kırmada

Dimetil sülfat

Piperidin

Piperidin

Piperidin

Hidrazin

Piperidin

Piperidin

Hidrazin+Baz

Piperidin

Piperidin

Piperidin

Piperidin

Pürinlerin kırılmasında dimetil sülfat kullanılır.

Dimetil sülfat ile N7 no’ lu pozisyonundan metillenen DNA’ ya bazik ortamda piperidin uygulanırsa DNA guanin bazından kırılır.

Bazik ortam yerine asidik ortam tercih edilirse bu sefer DNA guanin yerine adenin ii

Pirimidin bazlarının kırılması ise hidrazin ile yapılır.

Hidrazin DNA’ yı hem sitozin hem de timin bazından kırar.

Bu iki reaksiyonu ayırmak için ise yüksek tuz derişimi (2M NaCl) ve bazik ortam kullanılır.

Yüksek tuz derişimi ile bazik ortamda DNA sitozin bazından kırılır.

Dört farklı bazı ayırmada kullanılan reaksiyonlardan elde edilen parçacıklara elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülmeleri sağlanır.

Uygulanan elektiriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere yol alırlar.

İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde saptanan parçacıklar kırılma pozisyonlarına göre okunurlar (Klug et al.,

2000).

_ _ _ _ _ _ Kimyasal kırılma yöntemi ile yapılan reaksiyonların elektroforez sonrası görüntüsü ve okuma sonucu

GGGCTG Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yöntemi DNA dizi analizinde kullanılan diğer bir yöntem de Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir (Sanger et al.,

1977).

Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir.

Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.

DNA sentezini sağlamak için Klenov,

Taq DNA polimeraz,

ters transkriptaz ya da sekuenaz enzimlerinden birisi kullanılabilir.

Yöntemin temeli DNA polimerazın dNTP’ lerin (deoksiribonükleozit trifosfat) yanısıra deoksiribozun 3’ pozisyonunda OH grubu taşımayan ddNTP’ leri de

(dideoksiribonükleozit trifosfat)

substrat olarak kullanabilmesine dayanır (Şekil 2.2).

Sentezlenen DNA’ ya bir ddNTP’ nin katılması 3’

pozisyonunda OH grubu olmadığı için sentezi durdurur.

Dizi analizi

yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır.

Her bir karışım kalıp DNA zinciri,

dNTP’ lerin dördü ve az miktarda ddNTP’ lerden birini içerir.

Özgül zincir iii

sonlanması için her bir reaksiyonda farklı bir ddNTP bulunur.

Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleotit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti meydana gelir (Klug et al.,

2000).

NH2 N

(a) dATP (b) ddATP molekülleri.

Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yanyana yürütülür.

Uygulanan elektiriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur.

İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde,

tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddNTP’ nin tipine göre okunur (Klug et al.,

2000).

_ _ _ _ _ _ Enzimatik zincir sonlanma yöntemi ile yapılan reaksiyonların elektroforez sonrası görüntüsü ve okuma sonucu

GGGCTG Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde Kullanılan Kimyasallar Primerler

Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır.

Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’nın genomik DNA’dan eldesinde,

çoğaltılmasında kullanılır.

Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3’ ucu sağlar.

Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir.

Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizi reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır.

Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur (Sambrook et al.,

1989).

Kalıp DNA Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift,

hem de tek zincirli DNA kullanılabilir.

Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase

Chain Reaction,

PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır.

PCR ürünü kalıp DNA,

önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır.

Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır.

Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun hassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al.,

1989).

Enzimler Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir çok tipde DNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir.

Bu enzimlerin ortak özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.

Aşağıda kullanılan enzimlere örnekler verilmiştir (Sambrook et al.,

1989).

E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük dezavantajı vardır.

Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir.

Özellikle uzun okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir.

İkincisi enzimin homopolimerik bölgeler ile ikincil yapısı kuvvetli olan bölgelerde istenilen verimde çalışmamasıdır (Sambrook et al.,

1989).

Ters Transkriptaz Ters transkriptaz (Reverse transcriptase) enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir.

Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır (Sambrook et al.,

1989).

Sekuenaz Enzimleri Sekuenaz (SequenasesTM) enzimleri T7 bakteriofajın’dan elde edilirler.

Enzimin 3’-5’ ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir.

İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır.

Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir (Sambrook et al.,

1989).

Taq DNA Polimeraz Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir.

Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür.

Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir (Sambrook et al.,

1989).

Elektroforez DNA molekülleri fosfat grubu taşıdıkları için eksi (-) yüklüdür ve anoda doğru (+ kutba) hareket eder.

Bu hareket DNA’ nın yapısına ve uzunluğuna bağlıdır.

Jel boyunca kısa DNA fragmentleri daha hızlı yol alırken uzunluk arttıkça DNA’ nın hızı azalır.

Her iki dizi analizi yöntemi ile elde edilen farklı uzunluklardaki fragmentlerin birbirlerinden ayrılması ve tanımlanmasında DNA’nın bu özelliği kullanılır.

Birbirlerinden farklı sonlanmalara sahip reaksiyon ürünleri dört ayrı kulvarda söz konusu jel matrikse yüklenir.

DNA fragmentleri oluşturulacak elektriksel alanda uzunluklarına göre sıralanırlar ve DNA dizisi jelden okunur.

Poliakrilamid jeller her iki teknik için de kullanılır ve yüksek ayırım gücüne sahiptir.

Poliakrilamid jeller uygun süre ve uygun voltajda tek bir nükleotit farkını bile ayırabilir.

DNA dizi analizi reaksiyonu sonucu elde edilen fragmentler jel üzerinde gümüş boyama,

radyoaktif veya floresan boyalarla işaretlenerek tespit edilebilir.

Otomatik DNA cihazlarının gelişmesi ile poliakrilamid jellerin yerini polikarbon bileşikleri olan polimerler almıştır.

Bu polimerler yoğunluklarına göre farklı ayrım gücüne sahiptirler.

Kullanılan polimer otomatik cihazlarda çapları milimetreden küçük olan cam kapilerler içine yüklenirler.

Böylece poliakrilamid jellerde meydana gelen problemler en aza indirilmiş olur (Sambrook et al.,

1989).

Otomatik DNA Dizi Analizi İnsan Genom Projesi gibi büyük projeler çok sayıda DNA dizi analizi yapılmasını gerektirmektedir.

Artan analiz sayısı,

uzun zaman ve yüksek iş gücü gerektirir.

Bu gelişmeler sonucunda otomasyon kaçınılmaz olmuştur.

Otomatik DNA dizi analizleri zaman kazancı yanında,

standart çalışma koşulları ve elde edilen sonuçların değerlendirilmesinde de yarar sağlamıştır.

Otomatik analizde de Sanger’ in enzimatik DNA sentezine dayanan zincir sonlanma yöntemi kullanılmıştır.

Otomatik DNA dizi analiz cihazları basit olarak,

sabit bilgisayarda yüklü programlar ile bu programların yönettiği elektroforez sistemini içerir.

Elektroforetik ünitelerde bulunan lazer ışık kaynağı ile monokromatik bir ışık oluşturulur.

Söz konusu DNA’ nın bulunduğu jelmatriks bu monokromatik ışık ile taranır.

Elektroforez süresince DNA’ ya bağlanan floresan boya ışık ile taranan bölgeye geldiğinde uyarılır.

Uyarılan boya kendi için karakteristik olan dalga boyunda ışığı geri yansıtır.

Yansıyan bu ışık demeti bir detektör tarafından kaydedilir.

Kaydedilen veriler bilgisayar programları ile değerlendirilerek sonuçlar grafiksel ya da matematiksel olarak bilgisayar ekranına aktarılır.

DNA dizi analizi cihazlarında 6 bazdan 1000 baza kadar güvenli okuma yapılabilmektedir (Sambrook et al.,

1989).

ABI Prism 310 Genetik Analizatörü Kendinden önceki sistemlerden farklı olarak ABI Prism 310 Genetik Analizatörü poliakrilamid jelmatriks sistemi yerine kapiler sistem içine doldurulan polimer jelmatriks sistemi içerir.

Bu polimer jelmatriks çapı nanometre

ölçütlerinde olan cam borular

içerisine doldurulur.

Cihaz iki ana parçadan oluşur.

Birinci kısım veri ünitesidir.

Veri ünitesi bir bilgisayar sisteminden ibarettir.

Bu bilgisayarda,

ikinci kısım ile bağlantıyı kuran ve ikinci kısmı kontrol eden programlar yüklüdür.

İkinci kısım analizin yapıldığı elektroforez kısmıdır (Perkin Elmer,

2000).

Kontrol Sistemi Tipik bir masa üstü bilgisayar sistemidir.

Bu sistemde iki ana program yüklüdür.

İki programdan birinin görevi elektroforez cihazı ile bağlantıyı kurmak,

elektroforez koşullarını sağlamak ve verileri toplamaktır.

İkinci programın görevi ise toplanan vii

verilerinin değerlendirilmesidir.

ABI Prism 310 Genetik Analizatöründe “DATA CollectionTM” programı birinci tip bilgisayar programına örnektir.

“Sequance AnalyseTM” programı ise cihazın ikinci tip programıdır.

Elektroforez Ünitesi Bu kısım hazırlanan örneğin yüklendiği ve elektroroforezin gerçekleştiği kısımdır ve üç üniteden oluşur .

Örnek yükleme ünitesi Yükleme ünitesinde örnek yükleme tepsisi ile tepsiden bağımsız 3 kuyucuk vardır.

Bu üç kuyucuktan birincisine içinde yürütme tamponu bulunan tüp yerleştirilir.

Bu çözelti elektroforez sırasında uygun akımın oluşmasını sağlar.

İkinci ve üçüncü kuyucukta distile su bulunur.

Bu kuyucuklarda kapiler sistemin örneklere temas eden kısımlarının temizliği otomatik olarak yapılır.

Dedektör Ünitesi Kapilerin (cam boru) bir ucu platin bir çubuğun yanındadır.

Platin çubuk katot görevi görür.

Platin çubuktan polimer bloğa kadar olan bölüm lazer ünitesi hariç,

ısıtıcı ile sabit sıcaklıkta tutulan bir zemin üzerindedir (ısı ünitesi).

Bundan sonra gelen lazer okuyucu ünitesi özel kapaklı bir kutucuk içerisindedir (dedektör ünitesi).

Bu ünite sonunda kapiler,

polimer blok içerisinde sabitlenir.

Jel Blok Ünitesi Jel blok ünitesi üzerinde şırınga takmak için uygun bir delik bulunur.

Buraya takılan şırınga içinde kapilere doldurulacak olan stok polimer bulunur.

Şırınga üzerinde bulunan bir piston ile kontrol edilir (şırınga pistonu).

Polimer bloğun son kısmı ise bir kapakla yürütme çözeltisi ve anodun bulunduğu bölüme açılır.

ABI Prism 310 Genetik Analizatörü Çalışma Programı

Örnek hazırlandıktan sonra cihazda bulunan örnek tepsisine yerleştirilir ve cihaza başlama komutu verilir.

Başlama komutu ile cihazın gerçekleştirdiği işlemler şu şekilde sıralanır (Perkin-Elmer,

2000).

Cihaz polimer blok sonunda bulunan ve anoda açılan kapağı kapatır.

Polimer şırıngası üzerinde bulunan piston ile sıkıştırılır.

Polimer,

anot tarafı kapalı olduğu için hareket edebileceği tek yön olan kapiler içine yayılmaya başlar.

polimer ile doldurulduktan sonra serbest kapiler ucu örnek tepsisi üzerinde hareket ederek örnek içerisine girer.

Yaratılan elektriksel alanda tüp içerisinde bulunan DNA parçaları kapiler boru içerisine doğru harekete geçerler.

DNA parçalarının kapilere taşınması için gerekli sürenin dolması ile akım kesilir ve serbest kapiler ucu distile su içerisine döner.

Burası kapiler serbest ucu için son noktadır.

Örnek tepsisi üzerinde bulunan yürütme çözeltisi ile polimer blok sonunda bulunan yürütme çözeltisi arasında 14000 V’ ye varan bir gerilim oluşur.

DNA parçaları kapiler serbest ucundan kapiler boyunca,

polimer bloğa doğru harekete geçerler.

Bu yürütme sırasında lazer ünitesi

içerisinden geçerler ve yaydıkları floresan ışık ile tespit edilirler.

Elektroforez sonlandığında cihaz yeni deney için işlemleri tekrar eder.

ABI Prism Big DyeTM Terminatör Reaksiyon Kiti “ABI Prism Big DyeTM“ terminatör reaksiyon kiti içerisinde AmpliTaq DNA polimeraz içeren bir PCR kitidir.

Kullanılan polimeraz enzimi Thermus aquaticus‘ dan elde edilir.

Bu enzimin 5’-3’ nükleaz aktivitesi ile fosfataz aktivitesi inhibe edilmiştir.

Kiti diğer kitlerden ayıran özellikler aşağıda sıralanmıştır (PE Applied Biosystems,

1998).

Bu karışıma primer ve DNA eklenir.

Dolayısı ile kişisel hatalar en az seviyededir.

“ABI Prism Big DyeTM” terminatör reaksiyon kiti içerisinde bulunan karışım içerisinde PCR için gerekli tüm kimyasallar yanında her bir bazın eşit miktarda ddNTP’ leri de bulunur.

Bu ddNTP’lerin her biri farklı bir floresan boya ile işaretlenmiştir (Çizelge.2.2).

Bu sayede tek bir reaksiyonla dizi analizi yapılabilir.

Kit –15 ile –25 0C arasında saklanır.

Kit tüm kalıp DNA’ lar için ortak bir PCR protokolü içerir ve PCR süresi ortalama 2,5 saattir (PE Applied Biosystems,

1998).

“ABI Prism Big DyeTM terminatör reaksiyon kitinde ddNTP’ lerin işaretlendikleri floresan boya isimleri ile bunlara karşılık gelen renkler.

Florasan Boya

Yeşil

Kırmızı

dR110

dTAMRA

Siyah

KAYNAKLAR Klug,

S.W.,

Cummings,

W.R.,

Prentice Hall,

New Jersey 745 p..

Maxam,

Gibert,

1977,

A new method of sequencing DNA.

Proceedingsof the National Academy of Sciences,

ABI Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit protocol,

Perkin Elmer,

ABI 310 Genetic Analyzer Manuel,

2000.

Sambrook,

Fritsch,

E.F.,

Maniatis,

Cold spring harbor laboratory Press New York.

Sanger,

Nicklen,

Coulson,

A.R.,

DNA sequencing with chain- terminating inhibitors.

1977,

Proceedings of the National Academy of Sciences,

5463-7.

Zülal,

2001,

İnsan Genomu,

kalıtım şifresinin peşinde 136 yıl,

Tübitak Yayınları,